产品简介:
聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE),其原理在于聚丙烯酰胺凝胶为网状结构,具有分子筛选效应。它有两种形式:非变性聚丙烯酰胺凝胶及SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE);非变性聚丙烯酰胺凝胶蛋白质能够保持完整状态,并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开,主要用于分离蛋白质和寡核苷酸。常规SDS-PAGE凝胶电泳适用于分离大分子蛋白,对于小分子量的蛋白或多肽,分辨率大大降低。Tricine-SDS-PAGE电泳能够较好的分离10KD以下的蛋白或多肽,是电泳法分离多肽的主要方法,30T一般可以配制30~35块胶,具体配制的量应根据器具大小决定。电泳分离后可直接考马斯亮蓝染色、银染等。
操作步骤(三点校准通用,仅供参考):
1、 配制10%过硫酸铵(APS):直接在0.3gAmmonium Persulfate中加入3ml蒸馏水,充分溶解,分装成小份储存于-20℃或4℃。
2、 根据目的蛋白分子量大小选择合适的凝胶浓度,按照附表配制分离胶:
①将不同体积的蒸馏水、49.5%T 6%C、Gel buffer、Glycerol加入到离心管中充分混合。
②加入10%APS和TEMED,立即涡旋混匀5~10s,以使溶液充分混匀。
③在凝胶模具中迅速灌入适量分离胶溶液(1mm mini-gel,分离胶溶液加约4ml),然后在分离胶溶液上轻轻覆盖一层1~3cm的水层,使凝胶表面保持平整。
④静置,待分离胶和水层之间出现一个清晰的界面表示凝胶已聚合。
3、 根据目的蛋白分子量大小选择合适的凝胶浓度,按照附表配制夹层胶:
①去除覆盖在分离胶上的水层,用滤纸将残留的水尽量吸去。
②将不同体积的蒸馏水、49.5%T 3%C和Gel buffer加入到离心管中混合。
③加入10%APS和TEMED,立即涡旋混匀5~10s,以使溶液充分混匀。
④将适量的夹层胶溶液迅速加至分离胶的上面(对于1mm的mini-gel,夹层胶溶液加约1ml),然后在夹层胶溶液上轻轻覆盖一屋1~2cm的水层,使凝胶表面保持平整。
⑤静置,待夹层胶和水层之间出现一个清晰的界面表示凝胶已聚合。
4、 根据目的蛋白分子量大小选择合适的凝胶浓度,按照附表配制浓缩胶:
①去除覆盖在分离胶上的水层,用滤纸将残留的水尽量吸去。
②将不同体积的双蒸水、49.5%T 3%C和Gel buffer加入到离心管中混合。
③加入10%APS和TEMED,立即涡旋混匀5~10s,以使溶液充分混匀。
④将梳子插入凝胶内,避免产生气泡。
⑤静置,待凝胶聚合后,小心地拔出梳子,避免破坏加样孔。进行电泳操作。
5、 电泳
将电泳槽置于4℃或冰水浴中,外槽加入阳极缓冲液,内槽加入阴极缓冲液,30V预电泳10min,将处理好的样品加入点样孔,30V电泳1h,100V电泳至溴酚蓝到达胶底部后停止电泳,进行后续的考马斯亮蓝染色或电转。
注意事项:
1、 过硫酸铵配制成10%APS溶液后应当-20℃保存,用2~3次,亦可4℃保存几天。
2、 TEMED易挥发,使用后请盖紧瓶盖。另外凝胶凝聚的速度和温度及光照关系密切,可通过适当调节TEMED的用量,控制在不同的室内环境下凝胶凝聚的速度。
3、 配制聚丙烯凝胶的过程中,如果室温较低,可以置于37℃放置,加速凝固。在液体混匀的时候应尽量避免气泡的产生。
4、 在分离胶上层加蒸馏水时要缓慢,速度不宜过快。
5、 49.5%T 3%C和49.5%T 6%C为不同比例的Acr-Bis,有轻微神经毒性,请小心操作。