产品简介:
蛋白质分子中存在含有共轭双键的酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸,使蛋白质在270~290nm波长范围内具有的性质,其中酪氨酸的最大吸收峰为275nm,色氨酸的最大吸收峰为280nm,苯丙氨酸的最大吸收峰为257nm。在上述波长范围内,蛋白质溶液的吸收值与其浓度呈正比,可作定量测定。
紫外法蛋白定量试剂盒优点是:操作迅速、简便,不易受低浓度盐类的干扰;缺点是与标准蛋白中酪氨酸、色氨酸含量差异较大的蛋白质,准确性较差。样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸会干扰检测结果。
自备材料:
1、 分光光度计或酶标仪
2、 96孔板或离心管
操作步骤(仅供参考):
1、 用去离子水或蒸馏水稀释蛋白稀释液(10×)至1×,即为蛋白稀释工作液。取1支20mg的蛋白标准,加入20ml蛋白稀释工作液,即配制成蛋白标准(1mg/ml),-20℃保存。
2、 标准曲线法:取若干试管或96孔板,如下操作以分光光度法为例。选用1cm的石英比色皿,在280nm处以第1管作为调零点,分别检测各管吸光度,以A280为纵坐标,以蛋白质浓度为横坐标,绘制标准曲线。
取1ml待测蛋白加至3ml的蛋白稀释工作液中,混匀,分光光度计或酶标仪测定A280。
根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度。
3、 Lowry-Kalckar法(又称280nm和260nm吸收差法):对于含有核酸的蛋白质,无需制作标准曲线。以蛋白稀释工作液作为调零点,取1ml待测蛋白加至3ml的蛋白稀释工作液中,混匀,分光光度计或酶标仪测定A280和A260。根据经验公式计算出待测样品的蛋白浓度,如果蛋白浓度过高应用蛋白稀释工作液稀释后再行检测。 蛋白质浓度(g/L)=1.45×A280-0.74×A280
4、 Waddell法(又称215nm和225nm吸收差法):对于蛋白质含量较少的溶液,适用于该法。取若干试管或96孔板,如下操作以分光光度法为例。以蛋白稀释工作液作为调零点,取1ml蛋白标准(1mg/ml)加至3ml的蛋白稀释工作液中,混匀,分光光度计或酶标仪测定A215 和A225。以215nm和225nm吸光度值之差(D= A215- A225)为纵坐标,以蛋白浓度为横坐标,绘制标准曲线,再测出未知样品的吸收差,即可由标准曲线查出未知样品的蛋白质浓度。或者不用制作标准曲线,直接按照如下经验公式计算:
蛋白质浓度(g/L)=144×(A215-A225 )
注意事项:
1、 蛋白标准(BSA)粉末溶解于蛋白稀释工作液,该液中含有防腐剂,不影响后续检测,该蛋白标准液-20℃保存。
2、 待测蛋白溶解于什么样的稀释液中,蛋白标准也宜溶解于什么样的稀释液中,否则待测蛋白与蛋白标准中所含非蛋白成分不一致,有可能导致测定不准确。
3、 如果没有分光光度计,也可以使用酶标仪测定,但应考虑根据比色皿的最小检测体积。
4、 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。