产品简介:
目前世界上最常用的蛋白浓度检测方法是:BCA蛋白定量试剂盒(BCA Protein Assay Kit)和Bradford蛋白定量试剂盒(Bradford Protein Assay Kit)。Bradford法与传统方法相比,更简单、更稳定、兼容性更好。Bradford法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响。样品中β-巯基乙醇的浓度可高大1M,DTT的浓度可高达5mM。但受高浓度的去垢剂的影响明显,故在用Bradford Protein Assay Kit进行蛋白定量时,需确保SDS低于0.01%, Triton X-100低于0.05%,Tween20,60,80低于0.015%。含高浓度去污剂的蛋白定量,建议采用BCA Protein Assay Kit。
Bradford Protein Assay Kit主要由G250、缓冲液等组成,检测速度很快,少量样品一般只需10min即可完成检测。检测浓度下限达到25μg/ml,最小检测蛋白量达到0.5μg,待测样品体积为1~20μl,在50~1000μg/ml浓度范围内有较好的线性关系。
自备材料:
1、 酶标仪或分光光度计
2、 96孔板
3、 蒸馏水
操作步骤(仅供参考):
1、 完全溶解蛋白标准(BSA 5mg/ml),按蛋白标准:稀释液=1:9进行稀释,如取蛋白标准10μl稀释溶解于稀释液90μl,使其终浓度为0.5mg/ml。注意:蛋白样品在什么溶液中,蛋白标准也应用什么溶液稀释。也可以用0.9%NaCl或PBS稀释蛋白标准(BSA 5mg/ml)。
2、 将标准品按0,1,2,4,8,12,16,20μl加到96孔板的标准品孔,加稀释液补足至20μl。
3、 加适当体积样品到96孔板的样品孔中,补加标准品稀释至20μl。
4、 各孔加入200μl G250染色液,室温放置3~5min。
5、 酶标仪测定595nm波长处的吸光值,560~610nm之间的波长也可。
6、 根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度。
注意事项:
1、 G250染色液回复至室温充分混匀后使用,有利于提高检测的灵敏度。
2、 蛋白标准在全部溶解后先混匀,再稀释成一系列不同浓度的蛋白标准。
3、 待测蛋白溶解于什么样的稀释液中,蛋白标准也宜溶解于什么样的稀释液中,否者待测蛋白与蛋白标准中所含非蛋白成分不一致,有可能导致测定不准确。
4、 需可检测560~610nm之间波长的酶标仪一台,最佳检测波长为595nm。
5、 建议每次测定时都做标准曲线。因为测定时颜色会随着时间的延长不断加深,并且显色反应的速度和温度有关,所以除非精确控制显色反应的时间和温度,否则如需精确测定应每次都做标准曲线。
6、 如果没有酶标仪,也可以使用普通的分光光度计测定,但测定时,考虑根据比色皿的最小检测体积。应按比例适当加大G250染色液的用量使总体积不小于最小检测体积,样品和标准品的用量亦相应按比例放大。使用分光光度计测定蛋白浓度时,每个试剂盒可以测定的样品数量可能会显著减少。
7、 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。